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唾液组学在口腔癌诊断中的应用

2019-04-29 00:00:36
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作者:李倩,张平,陈娇,曾昕,冯云,四川大学华西口腔医学院

唾液作为一个巨大的生物标志物储存库,具有重要的研究价值。全唾液主要由唾液腺分泌,龈沟液、黏膜渗出液及微生物分泌物也参与其组成,其中含有丰富的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)、蛋白质、细胞因子,以及大量微生物和其代谢产物等。Wong建立了唾液组学数据库(salivaomics knowledge base,SKB;http://www.skb.edu),系统性搜集唾液组学相关的数据资料。SKB也是目前唯一一个致力于唾液组学研究的网站,该网站存储了大量人类唾液生物学、蛋白质组学、基因组学等方面的信息。

口腔癌作为最常见的恶性肿瘤之一,总体生存率仅约60%,而早期诊断和治疗则是提高其生存率的关键。因此,通过唾液组学的研究,寻找高敏感、特异性的口腔癌相关生物学标记物成已为当前的热点。肿瘤在发生、发展过程中产生的某些中介因子可使唾液内某些生物分子的表达谱发生特征性改变,这些改变的分子则可作为唾液生物靶标用于研究及临床诊治。在过去的几十年中,已有大量潜在的口腔癌生物标志物在唾液中被相继报道。因此,本文就唾液组学与口腔癌的诊断进行综述。

1. 唾液组学

唾液组学主要涵盖了唾液的基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、微生物组学及微小RNA(microRNA,miRNA)等领域。其中,唾液基因组主要包括人类及口腔微生物的DNA,人类DNA约占70%。与血液、尿液DNA相比,唾液DNA的质量和产量更优,存储时间相对较长,且与血液基因组DNA的基因分型结果完全一致。故唾液可作为疾病诊断和预后判断可靠的DNA来源。唾液转录组是一个复杂的RNA网络结构,包含了3 000~6 400种人类唾液信使RNA(messenger RNA,mRNA),约200种mRNA为不同个体所共有,构成了人类唾液转录组的核心。

研究表明,唾液mRNA中转录本的3’区富含AU元件,能够与蛋白质稳定结合,是比较理想的唾液标志物来源。唾液蛋白质组由2 000余种行使不同生物功能的蛋白质和肽构成,其中近40%的蛋白质可作为癌症、心血管疾病和中风等疾病的候选标记物。另外,唾液中存在大量的低丰度蛋白质,使之较血液蛋白质组具有显著优势。唾液代谢组学运用高通量技术系统地研究唾液中的小分子量物质(包括中间代谢产物、激素和某些信号分子等),这些代谢产物是分子通路的下游产物,可被其他“组学”调控,因此唾液代谢组学可用于定义个体表型,有助于口腔癌的精准诊断、靶向治疗。

口腔中大量的微生物群落与肿瘤间也存在密切关系,目前已有大量研究对口腔微生物感染与肿瘤发生、发展的关系进行探讨;miRNA的丢失或突变可促进肿瘤形成,与mRNA相比,它更能特异性地出现在不同类型的实体瘤中,且在肿瘤细胞和正常细胞间的区别比mRNA更显著。所以,miRNA作为特异性肿瘤生物标志物具有巨大潜力。

2. 唾液组学与口腔癌早期诊断

2.1 唾液基因组学与口腔癌

p53基因是迄今与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,位于染色体17p13.1,包含11个外显子和10个内含子。人类50%以上的肿瘤组织中存在p53基因突变。已有大量研究明确了口腔鳞状细胞癌患者的癌组织中存在p53基因的突变,在口腔鳞状细胞癌患者的唾液中也发现了p53基因的突变,说明唾液中p53基因突变的检测与癌变组织内部的检测结果具有较好的一致性,可作为快速诊断口腔癌的可靠生物学标志物。随着研究的不断深入,许多学者认为,肿瘤的发生是多基因协同作用的结果。

有研究表明,在涎腺肿瘤的发生、发展中,Ki-67检出率与p53存在一致性关系,其共同作用导致涎腺肿瘤的发生、发展。除Ki-67外,对细胞凋亡发挥重要的调节作用的bcl-2基因家族也与p53基因具有协调作用,p53基因被证明通过下调bcl-2表达、上调Bax基因表达而直接影响细胞凋亡。抑癌基因p16即编码多肿瘤抑制因子(multiple tumor suppressor,MTS)的基因,位于染色体9p21,其与p53基因在肿瘤的发生、发展过程中相互影响、相互作用,对正常细胞的生长和分化有重要作用。与p53基因相关联的基因还有p21、p27等。但这些基因作为口腔癌检测的标志物还需要进一步证实。

DNA甲基化是由酶介导的化学修饰过程,对细胞的发育、基因组的稳定至关重要。DNA甲基化模式改变包括DNA低甲基化和启动子CpG岛高甲基化,对肿瘤的发生具有重要意义。通过该机制致癌的基因包括:1)抑癌基因(p14、p15、p16),影响细胞生长周期;2)粘附素(cadeher in)家族(E-粘附素、N-粘附素和P-粘附素),影响肿瘤的侵袭、转移;3)14-3-3σ基因甲基化,引发基因失活而导致肿瘤;4)Ras相关结构域家族(Ras related domain family,RASSF)基因1A启动子甲基化与人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染协同致癌;5)DNA修复基因[包括编码甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(methylguanine DNA methyltransferases,MGMT)、人MutL同源蛋白1(human MutL homologous protein 1,hMHLl)的基因]及细胞凋亡基因[编码死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)的基因],参与口腔癌的发生等。

大量文献报道了口腔鳞状细胞癌患者存在异常甲基化的p16、MGMT及DAPK。另外,Guerrero-Preston等的研究表明,唾液中NID2和HOXA9基因启动子甲基化与口腔鳞状细胞癌的发生、发展关系密切,可作为筛查口腔鳞状细胞癌高危患者及早期诊断的生物学标记物。

早在19世纪,有学者发现,术前唾液中含有甲基化基因的鳞状细胞癌患者,术后却不能检测到,这一发现使人们对唾液用于口腔鳞状细胞癌的检测产生了极大兴趣。大量后续研究结果也证实了口腔癌患者唾液中甲基化基因的检测结果与病变组织是基本一致的。Nagata等在对比口腔鳞状细胞癌患者与正常人唾液中的13个基因时发现,鳞状细胞患者唾液中有8个基因甲基化水平较正常人明显升高,它们作为联合指标时的灵敏度和特异性高于90%,这一结果进一步说明唾液中基因的甲基化可作为口腔癌筛查、诊断的生物标记物。

关于杂合性丢失、微卫星不稳定性与口腔癌的关系的研究并不少见,其中D3S1234、D9S156和D17S799的杂合性丢失与口腔鳞状细胞癌相关,可作为口腔癌筛查的唾液标志物。唾液中的线粒体DNA及肿瘤相关病毒DNA,如HPVDNA、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)DNA和人类疱疹病毒(humanherpes virus,HHV)DNA、Epstein-Barr(EB)病毒DNA等也可用于口腔癌的风险评估。

2.2 唾液转录组学

与口腔癌与DNA一样,唾液中mRNA作为生物标记物在口腔癌的研究、诊断中得到广泛应用。Li等利用Human Genome U133A微阵列芯片分别分析了32例口腔鳞状细胞癌患者和正常人的唾液,结果显示两组间有1 679个基因存在明显差异。其中,鳞状细胞癌患者唾液中有836个相关mRNA较正常组表达高,升高十分显著(>3.5倍)的有以下7种蛋白质的相关mRNA:白细胞介素(interleukin,IL)-8、IL-1β、人双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1,DUSP1)、人组蛋白HA3、鸟氨酸脱羧酶抗酶1(ornithine decarboxylase antizyme 1,OAZ1)、s100钙结合蛋白p和丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase,SAT),且灵敏度与特异性均为91%。根据mRNA增高程度分为高度增加(IL-8)、中度增加(HA3、IL-1β、s 1 0 0 钙结合蛋白p)和低度增加(DUS P 1 、OAZ1、SAT)。这一研究验证了唾液中的转录物同样可用于鳞状细胞癌的诊断和筛查。

Brinkmann等进一步分析研究了51例健康者、18例T1~T2期及17例T3~T4期鳞状细胞癌患者的唾液mRNA,发现与单项生物标志物相比,多种生物标志物联合检测的灵敏度更高,其中IL-lβ+SAT1+DUSP1复合物在T1~T2期鳞状细胞癌患者唾液中升高,而DUSP1在T3~T4期鳞状细胞癌患者唾液中升高,并且这些肿瘤生物标志在鳞状细胞癌晚期时的灵敏度更高。由此可见,唾液中的各种mRNA除了用于口腔癌的早期诊断外,也可以用于初步分期,且多种生物标志物联合应用的意义更大。

2.3 唾液蛋白质组学与口腔癌

随着唾液蛋白质组学的发展,Bandhakavi等建立了目前最大的唾液蛋白质组数据库。癌胚抗原、肿瘤相关抗原抗体、肿瘤生物学相关蛋白质都是当前研究的热点,在口腔癌的早期诊断、预后评估等研究中受到了极大的重视。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一种位于细胞表面的糖蛋白,正常存在于妊娠前期的胎儿肠道和肝脏中,在良性病变时可短暂、中度升高,在某些恶性肿瘤中明显升高,与肿瘤的发展程度呈正相关。多项研究证实了唾液中CEA检测对口腔癌的辅助诊断具有一定价值,对其分期也有一定指导意义。

除癌胚抗原外,唾液中另外一些癌症相关抗原、抗体等蛋白质,如肿瘤相关抗原(carcinoma associated antigen,CA)-50、CA-125、CA15-3及免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A、c-erbB2蛋白、抗肿瘤P53、Ki67抗体等,也可作为口腔癌或其他部位恶性肿瘤的生物标志物。特异性分解细胞外基质成分的透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)与口腔颌面部恶性肿瘤的发生、淋巴结转移等生物学行为密切相关;细胞快速生长所必需的转铁蛋白(transferrin,TF)的增加与鳞状细胞癌患者肿瘤的大小和分期呈正相关,它们都可能是诊断和筛查口腔癌的有效工具。唾液中的防御蛋白(defensin)-1、鸟苷蛋白、功能偶合蛋白在口腔鳞状细胞癌诊断中的生物学标记意义也得到了证实。

2.4 唾液代谢组学与口腔癌

肿瘤微环境中的生物活性介质(包括细胞因子、趋化因子等)在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。已被证实为潜在的生物标志物的介质有:IL-1、IL-6、IL-8,肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α,表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)及其受体表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),Her-2,碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)-1,内皮素(endothelin),基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和9等。

有研究显示,IL-6、IL-8在鳞状细胞癌患者唾液中升高显著,IL-8的表达量与肿瘤的体积呈正相关,且鳞状细胞癌患者唾液中IL-6、IL-8的含量较血清中更高,故唾液中IL-6、IL-8的检测对鳞状细胞癌的诊断更具有临床意义。EGF作为生长因子中的一员,以外分泌方式进入唾液,调控多种靶细胞的生长、分裂。唾液中EGF在口腔颌面部发生炎症及肿瘤时显著升高,且涎腺恶性肿瘤患者唾液中EGF水平较良性肿瘤患者升高更明显,这提示EGF在肿瘤的形成、恶性转化过程中有一定作用。

最新研究表明,EGF通过诱导人胰岛素样生长因子-2 mRNA结合蛋白3(insulin-like growth factor-2 mRNA binding protein,IGF2BP3)、平足蛋白(podoplanin,PDPN)的表达增加癌症的侵袭性,这提示EGF在肿瘤的形成、恶性转化过程中有一定作用。氨基酸作为蛋白质代谢的中间产物,在唾液组学的研究中也受到了极大重视。Sugimoto等研究表明,多种唾液代谢产物可用于口腔癌的检测,在口腔癌患者唾液中发现了28种特异性代谢产物,其中聚胺、鸟氨酸和腐胺的水平显著升高。

后续研究发现,鳞状细胞癌患者和健康人群的唾液代谢组学存在明显差异,包括胆碱、葡萄糖、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肉毒碱;与健康组相比,鳞状细胞癌组的胆碱代谢上调,其余代谢物均下调;并提出鳞状细胞癌患者存在氨基酸代谢和能量代谢的失衡,三羧酸循环代谢也存在异常,为将来的临床诊断和治疗提供了重要的信息。

广泛存在于血液及唾液中的唾液酸(sialic acid),因其异常糖基化行为符合癌症的普遍特征,在肿瘤研究中也备受关注。早在几十年前,研究者们发现带瘤动物及肿瘤患者的瘤体和血液中的唾液酸含量随病情的加重而升高,随病情的缓解而降低。之后,张书平等对鳞状细胞癌患者唾液中的唾液酸进行检测,结果表明,鳞状细胞癌患者唾液中唾液酸含量高于血清,并提出唾液中唾液酸的含量检测对口腔颌面部恶性肿瘤具有较高的参考价值。Vajaria等的研究进一步显示,唾液中的唾液酸、总蛋白质和总糖含量在鳞状细胞癌组显著高于对照组,证实了唾液中的唾液酸可作为潜在的肿瘤标志物,用于口腔癌的早期诊断。

2.5 唾液微生物组学与口腔癌

口腔微生物组群间及其与宿主间的动态平衡共同维持着口腔健康。这些差异微生物组群通过破坏机体的免疫系统、干扰上皮细胞的信号通路参与口腔癌的发生、发展;同时,肿瘤微环境的改变也可引发口腔菌群失调,促进某些特定种菌群的定植。Mager等发现,鳞状细胞癌患者唾液中的牙龈二氧化碳噬纤维菌、产黑色素普雷沃氏菌、缓症链球菌含量较正常者明显增加,这3种细菌作为鳞状细胞癌的辅助诊断指标,尚需大量临床研究的验证。Pushalkar等发现,鳞状细胞癌患者唾液中最主要的细菌属有链球菌属、孪生球菌属、罗氏菌属、消化链球菌属、乳杆菌属和卟啉单胞菌属。

Furquim等利用16S rRNA测序方法,在范科尼贫血患者口腔内检出了大量的厚壁菌、拟杆菌、普雷沃氏菌、韦荣氏球菌属和链球菌等,提出在范科尼贫血患者或者正常人中,口腔微生物可能在鳞状细胞癌的发展过程中起着重要的作用。这些结果都提示,口腔癌的发生伴随着微生物组群的结构改变,口腔微生物组学在口腔癌的诊断中具有潜在意义。

2.6 miRNA与口腔癌

唾液中miRNA在血浆、尿液、唾液及其他体液中稳定表达,且与许多肿瘤的发生密切相关。Salazar等对头颈部鳞状细胞癌患者唾液中的miRNA进行一系列分析后发现,唾液中的miR-9、miR-134和miR-191可以作为新型生物标记物检测头颈部鳞状细胞癌。此后,Momen-Heravi等在对口腔鳞状细胞癌患者的唾液的检测中发现了11个miRNA(miR-136、miR-147、miR-1250、miR-148 a、miR-632、miR-646、miR-668、miR-877、miR-503、miR-220a和miR-323-5p)表达显著下降,2个miRNA(miR-24和miR-27b)表达显著增高。综上,唾液中的miRNA作为一种快速、无侵袭性的工具,应用于口腔癌诊断也具有巨大潜能。

2.7 其他唾液标志物与口腔癌

迄今为止,已经有100余种唾液成分被纳为潜在的口腔癌标志物。除上述基因、mRNA、蛋白质、代谢物、微生物及miRNA外,还包括Na+、Ca2+、F-、Mg2+等无机离子,长链非编码RNA,氧化应激相关分子,糖皮质激素,糖基化产物唾液酸、α-L-岩藻糖苷酶及端粒酶等。这些生物标志物同样是唾液组学的重要组成部分,与口腔癌的生物学行为密切相关,对唾液组学的研究、口腔癌的个性化诊治具有重要意义。

3. 结语

综上所述,唾液因收集简单、储存方便、安全、廉价且含有丰富的生物学信息等,有望成为血液的良好替代品。通过大量的唾液学实验研究,学者们已经在唾液中发现了许多口腔癌相关的生物学标志物,对口腔癌的早期诊断做出了巨大贡献。但现阶段对唾液组学的研究还存在诸多障碍,如关于唾液的收集、处理和存储尚缺乏统一的标准;至今没有一个公认的特异性肿瘤标志物可以单独用于口腔癌的诊断,仍需通过多个肿瘤标志物联合检测以提高特异性和敏感性。不过,随着生物学技术的快速发展、研究的不断深入,相信在不久的将来,唾液组学诊断将会不断完善,为肿瘤的早期诊断、精准治疗及监测提供可靠的依据。

来源:李倩,张平,陈娇,曾昕,冯云.唾液组学在口腔癌诊断中的应用[J].国际口腔医学杂志,2018,45(06):710-715.


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